CYP450酶代謝表型研究原理及實驗方法

1 概述

1.1 藥物代謝研究簡介

藥物代謝研究是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要內(nèi)容，它不僅決定了創(chuàng)新藥物制劑研發(fā)的成敗，而且與創(chuàng)新藥物研發(fā)的速度和質(zhì)量有密切關(guān)系。因而，藥物代謝研究在新藥研發(fā)工程中具有*的重要作用，研究藥物代謝對于了解藥物在體內(nèi)的變化過程至關(guān)重要。

藥物代謝研究的方法主要分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)代謝法因藥物在生物體內(nèi)的分布較廣，加上代謝轉(zhuǎn)化的器官和酶系的多樣性，使藥物及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的濃度比較低，代謝產(chǎn)物的檢測具有一定的困難。體外代謝法在短時間內(nèi)可以得到大量的代謝產(chǎn)物，且代謝條件可控，代謝體系比較“干凈"，代謝物易于分離、提取，有利于代謝途徑研究及代謝產(chǎn)物結(jié)果的確定等，因而，體外代謝法具有突出的*性。

由于肝臟是藥物代謝的主要場所，體外代謝模型多以肝臟為基礎(chǔ)。目前，研究體外代謝方法主要有：肝微粒體體外溫孵法、重組P450酶體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、肝臟離體灌流法和肝切片法。其中，肝微粒體體外溫孵法與其他體外代謝方法相比，酶制備簡單，代謝過程快，重現(xiàn)性好，易大量操作，同時可用于藥物代謝酶的抑制及體外清除等方面的研究，因而在實際工作中應(yīng)用較為普遍。

1.2 CYP450酶代謝表型研究的意義

為獲得更好的治療效果，聯(lián)合用藥在臨床治療中已非常普遍。然而，在獲得更好的療效的同時，常伴隨著由藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）引起的不良反應(yīng)事件的發(fā)生。如特非那丁與酮康唑合用時，酮康唑可顯著地抑制特非那丁的代謝，造成特非那丁的血藥濃度顯著升高，可以導致致命的室間心律失常。因此，在新藥臨床前研究中，對藥物的代謝酶表型進行鑒定，獲得其主要代謝酶的消除比例，闡明參與藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶亞型，對于研究藥物的代謝機制，預測藥物代謝多態(tài)性和藥物間相互作用等方面具有重要意義。

藥物代謝酶表型鑒定，主要是研究參與藥物清除的代謝酶的類型、數(shù)量和相對貢獻率。如果藥物主要通過單一的代謝途徑對藥物進行清除，可能會存在很大的用藥風險；相反，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多，則說明其代謝途徑也越多，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。

北京匯智泰康生物技術(shù)有限公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，以化學抑制法為基礎(chǔ)，開發(fā)了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性好。

圖1為采用肝微粒體技術(shù)研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時可能會出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會影響臨床療效的正常發(fā)揮。

圖1 人肝微粒體中幾種臨床常用藥物對西尼地平代謝的影響

如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此，通過對代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中*的一部分。

1.3 CYP450酶及代謝表型研究方法

CYP450為一類含亞鐵血紅素蛋白的超家族，根據(jù)相關(guān)酶亞型在藥物代謝中的重要程度，可將CYP450分為以下三類：（1）主要CYP450，包括CYP1A2、CYP2C9 、CYP2C19 、CYP2D6 和CYP3A4；（2）較主要CYP450，包括CYP2B6、CYP2C8和CYP3A5；（3）次要CYP450，包括CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2E1、CYP2J2和CYP4A11等。參與藥物代謝的動物肝微粒體P450酶較為復雜，而人肝微粒體中參與藥物代謝的P450酶相對比較簡單，主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E和CYP3A，其組成見圖2。

圖2 人肝內(nèi)P450酶的組成

目前，CYP450的酶表型鑒定主要使用以下3種方法：選擇性抑制法、重組人源CYP450同工酶法、相關(guān)性分析法。選擇性抑制法又分為化學抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學抑制劑或抗體的條件下，分別測定人肝微粒體對藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計算相對抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學抑制法由于其操作簡單，且價格低廉而得到廣泛應(yīng)用。

2 實驗原理

參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個家族，共有7種重要的亞型，分別為CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4；

α-奈黃酮為CYP1A2的特異的選擇性抑制劑，毛果蕓香堿為CYP2A6的特異的選擇性抑制劑，噻氯匹定為CYP2C19的特異的選擇性抑制劑，奎尼丁為CYP2D6的特異的選擇性抑制劑，二乙基二硫代氨基甲酸鈉為CYP2E1的特異的選擇性抑制劑，酮康唑為CYP3A4的特異的選擇性抑制劑，磺胺苯吡唑為CYP2C9的特異的選擇性抑制劑，如選用特異的選擇性抑制劑抑制不同亞型的酶的活性，便可研究藥物的CYP450酶代謝表型。

3 實驗方法描述

肝微粒體體外溫孵法是采用肝微粒體，輔以NADPH再生系統(tǒng)，在體外模擬生理環(huán)境條件進行代謝反應(yīng)，經(jīng)過一定時間的反應(yīng)后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物和其代謝產(chǎn)物，并對代謝產(chǎn)物進行初步的分析和鑒定的方法。

3.1 肝微粒體制備

P450酶主要在肝臟中表達，肝臟中的P450酶在體外是以微粒體的形式存在的。微粒體是指在細胞勻漿和差速離心過程中獲得的由破碎的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自我融合形成的近似球形的膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，是異質(zhì)性的集合體。它包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核糖體兩種基本成分，在體外實驗中具有蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)糖基化和脂類合成等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本功能。目前，制備肝微粒體常用的方法是差速離心法。具體制備流程見下圖（圖3）：

圖3 肝微粒體制備流程圖

3.2 體外孵育體系的建立

CYP450酶代謝表型研究的肝微粒體體外孵育體系，是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶，再加入酶特異的選擇性抑制劑，在模擬生理溫度及生理環(huán)境的條件下進行生化反應(yīng)的體系。

推薦使用的孵育體系為：每個孵育體系總體積為200 µL，體系包括0.1M PH 7.4 的磷酸緩沖液，匯智泰康NADPH發(fā)生系統(tǒng)（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，3.3 mM的氯化鎂）；0.5 mg/mL的肝微粒體蛋白；適量的選擇性抑制劑；合適濃度的待測物，于37°C水浴孵育，每個樣品平行3次，以不加選擇性抑制劑組為對照。于預設(shè)的反應(yīng)時間點，加入等體積預冷的乙腈終止反應(yīng)。

3.3 原型藥物或代謝產(chǎn)物的檢測

采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC測定溫孵液中原型藥物或其代謝產(chǎn)物的濃度。

例：

下圖（圖4、圖5、圖6）為研究某一候選藥物的CYP450酶代謝表型的實驗，該實驗采用選擇性化學抑制劑的方法分析了該藥物在鼠、犬和人肝微粒體中的代謝情況，從而判斷微粒體中哪些CYP450亞型是該藥物的主要代謝酶。

數(shù)據(jù)計算：

用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率。

抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對照樣品代謝速率）×100%

圖4 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖5 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖6 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

從上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在差異。表明，不同種屬微粒體中參與該候選藥物代謝的酶亞型可能不同。

4 本公司CYP450酶代謝表型研究試劑盒簡介

北京匯智泰康生物技術(shù)有限公司針對CYP450酶代謝表型研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導，以化學抑制法為基礎(chǔ)，開發(fā)了一款專門用于CYP450酶代謝表型研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實驗周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，符合CYP450酶代謝表型研究試驗要求，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性好。

4.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了CYP450酶代謝表型研究用到的肝微粒體、NADPH再生系統(tǒng)、酶特異性抑制劑及其它組分，可直接用于藥物CYP450酶代謝表型研究。本產(chǎn)品可提供肝微粒體有：人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體，可根據(jù)實際需求，選擇不同種屬的肝微粒體。

4.2 試劑盒優(yōu)勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。

準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，實驗結(jié)果準確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。

4.3 產(chǎn)品組成

50反應(yīng)/盒，200μL/反應(yīng)。

4.4 產(chǎn)品使用說明

本產(chǎn)品需于-70℃冰箱冷凍保存，切記避免反復凍融。試驗具體操作如下：

4.4.1 試驗組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預孵育5min；

例：200μL孵育體系配制：

注：a.體系中有機溶劑加入量不得大于1%。

b.若實際需要n個孵育體系，則需配置n＋1個體系。

3）將以上混合液195μL/管分裝至1.5mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動代謝反應(yīng)，使用秒表計時；

4）于設(shè)定孵育時間點，向孵育體系中加入200μL預冷的乙腈終止反應(yīng)（預冷乙腈：孵育體系體積=1:1）。

4.4.2 對照組

1）加陽性底物組：反應(yīng)體系中不加選擇性抑制劑，并將受試物換為陽性底物，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

2）無抑制劑組：反應(yīng)體系中不加選擇性抑制劑，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊；

3）無A液、B液組：反應(yīng)體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補齊。

4.4.3 結(jié)果判定

   CYP450酶亞型與選擇性抑制劑對應(yīng)一覽表。

4.5 運輸條件

干冰運輸。

4.6 注意事項

1.試驗開始前，請自行準備1.5mL離心管、不同規(guī)格槍頭、乙腈、37℃水浴鍋等。

2.本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動物的治療或臨床診斷。

3.使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻。

4.于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復凍融。

5.在使用過程中，也可根據(jù)實際實驗需求調(diào)整各組分的加入量。